Kontroverse Diskussion um die Bürgerversicherung

28 Fortbildung

28 Fortbildung Teststreifen eluiert. Vorhandene RNA wird durch Zusatz von RNase A verdaut (Abb. 7a). Die isolierte bakterielle DNA wird anschließend mit einer Multiplex Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert. Hierbei werden (wie in diesem Fall für P. intermedia und T. forsythia dargestellt) je zwei Zielsequenzen gleichzeitig mittels spezifischer Primer vervielfältigt (Abb. 7b). Die PCR-Reaktion besteht dazu aus drei Schritten: (1) Denaturierung der DNA-Doppelstränge (bei ca. 95 °C), (2) Primerhybridisierung (Annealing) an den DNA-Eina b c Polymerasekettenreaktion. Molekularbiologische Grundlagen der real-time Polymerasekettenreaktion (PCR): PCR-Amplifikate werden mittels Hybridisierungssonden nachgewiesen. (a) Im Nativzustand sind sowohl das Fluorophor (hier Cy5 (Cy5- Succinimidylester)) wie auch der Quencher (hier BHQ-2) an die DNA-Hybridisierungssonde gebunden. Hierdurch wird die eine Lichtemission bei fluoreszenzoptischer Anregung des Fluorophors verhindert. (b) Während der DNA-Amplifikation bindet die Hybridisierungssonde komplementär an den entstehenden DNA-Einzelstrang. (c) Der DNA-Einzelstrang wird durch die DNA-Polymerase – ausgehend von den sequenzspezifischen 16S rRNA (ribosomale RNA) Gen Primerbindungsstellen – zum DNA-Doppelstrang vervollständigt. Hierzu nutzt die DNA-Polymerase die im Master Mix vorhandenen Nukleotide. Im Bereich der Hybridisierungssonde löst die DNA-Polymerase durch ihre 5‘→3‘ Exonukleaseaktivität den Quencher von der Sonde. Bei passender fluoreszenzoptischer Anregung des Fluorophors (hier 647 nm, rotes Licht) kann nun in Abwesenheit des Quenchers eine entsprechende Lichtemission (hier bei 662 nm, dunkelrotes Licht) stattfinden und vom Thermocycler detektiert werden. d e Abb. 9a-e (d) Bei der PCR erfolgt eine exponentielle Amplifikation der DNA-Zielsequenz und damit ein exponentieller Anstieg der Fluoreszenzintensität des PCR-Produktes. Je mehr bakterielle DNA in der Patientenprobe ursprünglich vorhanden war, desto schneller steigt die Fluoreszenzstärke der neu synthetisierten DNA über einen gerätespezifischen Schwellenwert (dunkelblaue bis grüne Kurven). Der sogenannte Ct-Wert (Threshold Cycle) ermittelt sich dann als Schnittpunkt der PCR-Amplifikationskurve mit dem Schwellenwert (i. d. R. Werte zwischen 10 und 35). (e) Über eine Standardkurve (bei bekannter Keimzahl (bzw. Kopienanzahl des amplifizierten Zielgens) lässt sich so die Keimzahl (Kopienzahl) jedes beliebigen Ct-Werts errechnen. titiserreger (P. gingivalis, T. forsythia, T. denticola, P. intermedia und A. actinomycetemcomitans) auf dem Nachweis polymorpher, hochspezifischer Gensequenzen (Internal Transcribed Spacer (ITS)) im Bereich der 16S rDNA (ribosomale Desoxyribonukleinsäure) des bakteriellen Genoms. Da bakterielle DNA relativ stabil ist, können die Erreger auch noch nach vielen Tagen problemlos auf einem Papierteststreifen detektiert werden. Initial wird hierzu die bakterielle DNA als gepoolter Probenansatz mittels verschiedener Lysepuffer vom ZBW 2/2018 www.zahnaerzteblatt.de

Fortbildung 29 Abb. 10a Abb. 10b Probenentnahme und Probentransport. Die Probenentnahme erfolgt mittels einer sterilen Papierspitze aus der entzündeten Zahntasche (a). Zum Probentransport des Papierstreifens wird dieser in ein steriles 2 ml Reagenzgefäß überführt und in einem gepolsterten Briefumschlag mit den entsprechenden Begleitscheinen zur Probenidentifikation (Patientendaten, Angaben zur Klinik) versendet (b). zelstrang (bei ca. 65 °C) sowie (3) Elongation des DNA- Einzelstrangs mittels DNA-Polymerase zum DNA-Doppelstrang (bei ca. 70 °C). Durchgeführt wird diese Reaktion in kleinen Reaktionsgefäßen in einem Thermocycler (Abb. 7c). Um das entstehende PCR-Produkt sichtbar zu machen, werden während der DNA-Neusynthese fluoreszierende Farbstoffe in das PCR-Produkt integriert. Mit zunehmender Produktmenge nimmt die – mittels einer Auswertsoftware sichtbar gemachte – Fluoreszenz exponenziell zu. Am Ende der PCR-Reaktion (nach Verbrauch der PCR-Reagenzien) flacht die Fluoreszenzintensitätskurve langsam ab (sigmoidaler Kurvenverlauf) (Abb. 7d, linke obere Grafik). Um Rückschlüsse auf die in der Probe vorhandene Keimmenge (blaue Kurven) ziehen zu können, werden für jeden Erreger vordefinierte PCR-Ansätze mit Lysaten bekannter bakterieller Konzentrationen von ATCC (American Type Culture Collection)-Referenzstämmen der jeweiligen Markerkeime mitgeführt (grüne Kurven) (Abb. 7d linke obere Grafik). Durch mathematische Transformation (lineare Regression) lässt sich so anhand der Kurvenverläufe die in der Probe vorhandene Erregermenge errechnen (Abb. 7d rechte obere Graphik) sowie benutzer- und einsenderfreundlich als Balkendiagramm im Arztbrief grafisch darstellen (Abb. 8). Für ein besseres Verständnis sind die molekularbiologischen bzw. mathematischen Grundlagen der real-time PCR sowie der linearen Regression in Abb. 9 genauer dargestellt (42). Probenentnahme und Präanalytik. Zur Bestimmung der bakteriellen Besiedlung können subgingivale Proben mithilfe dünner Papierstreifen entnommen und mittels einer sterilen Pinzette in einem Transportröhrchen für den Versand verpackt werden (Abb. 10a, b). Der bestmögliche Zeitpunkt für die Probenentnahme aus den parodontalen Taschen ist die Hygienephase. Dadurch wird gewährleistet, dass das Ergebnis des Tests zum Abschluss der Initialtherapie vorliegt. Die meisten kommerziellen Testsysteme bieten zur Gewinnung der Proben sterile Papierspitzen an (Abb. 10b). Die Probenentnahme sollte – soweit möglich – aus den am schwersten erkrankten Stellen eines jeden Quadranten erfolgen (20, 60). Da die Mundhöhle nicht primär steril ist, empfiehlt es sich, die Probenentnahmestelle zuvor supragingival zu reinigen und mit Watterollen trockenzulegen. Hierdurch werden die Kontamination mit der oberflächlichen Keimflora sowie ein unerwünschter Keimverdünnungseffekt der Erreger aus der Tasche durch Speichel minimiert. Die Papierspitze wird zügig und möglichst weit apikal in die Tasche eingebracht und dort für ca. 10 bis 20 Sekunden belassen (Abb. 10a). Anschließend wird die Papierspitze wieder aus der Tasche entfernt und mit den anderen Papierspitzen in ein Transportröhrchen gegeben (Abb. 10b). Da die relative Erregerlast an pathogenen Keimen therapieentscheidend ist, erfolgt die Bestimmung der Bakterienmenge gepoolt (34).* Antimikrobielle Therapieansätze. Eine effiziente antimikrobielle Therapie unterstützt das Immunsystem in der Erregerelimination. Sie reduziert nicht nur den parodontalpathogenen Anteil der subgingivalen Flora, sondern unterstützt auch die Verschiebung von einer dysbiotischen zu einer symbiotischen Mikroflora und damit die Etablierung eines „gesunden“ subgingivalen Ökosystems. Man unterscheidet zwischen bakteriziden (direkte Abtötung der Erreger) und bakteriostatischen Antibiotika (Hemmung des Keimwachstums). Da die kommensale bakterielle Normalflora vorwiegend aus grampositiven, aeroben Bakterien besteht und es sich bei den pathogenen Bakterien mehrheitlich um gramnegative Anaerobier handelt, sollte die Antibiotikatherapie nach Möglichkeit so konzipiert sein, dass die *Interessenskonflikte. Das Labor für Orale Mikrobiologie der Klinik für Zahnerhaltungskunde und Parodontologie und des Instituts für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene am Universitätsklinikum Ulm bietet einen PCR-Erregernachweis auf parodontalpathogene Bakterien an. www.zahnaerzteblatt.de ZBW 2/2018